Evaluación y desarrollo de modelos "in vitro" para la predicción de neurotoxicidad. Aproximación proteómica a la neurotoxicidad inducida por metilmercurio

[spa] En los últimos años ha habido un creciente interés en la utilización de métodos "in vitro" para la detección del potencial tóxico de compuestos químicos que contribuyan en remplazar, reducir y reformar el uso de animales en experimentación. Distintas organizaciones nacionales e internacionales están trabajando en el desarrollo y la validación de métodos "in vitro" que proporcionen el mismo nivel de información que los modelos in vivo. Se estima que entre el 3-28 % de los compuestos químicos existentes son potencialmente neurotóxicos. Respondiendo a la necesidad de impulsar la utilización de métodos "in vitro" en el campo de la neurotoxicología, el Centro Europeo para la Validación de Métodos Alternativos (ECVAM) propuso la elaboración de una base de datos de métodos alternativos para la detección de compuestos químicos potencialmente neurotóxicos. Los objetivos planteados en este trabajo contemplan estudios bibliométricos y experimentales para (1) la creación de una bases de datos de métodos "in vitro" para la detección de compuestos químicos potencialmente neurotóxicos, (2) para la caracterización de proteínas y la identificación de marcadores de toxicidad mediante herramientas proteómicas utilizando como modelo celular cultivos primarios de células granulares de cerebelo de ratón y como agente tóxico el metilmercurio y (3) la evaluación de los mecanismos de muerte y neuroprotección de células granulares de cerebelo expuestos a metilmercurio. Tras un estudio bibliométrico, se propusieron 6 métodos in vitro para evaluar el potencial tóxico de compuestos químicos capaces de producir axonopatías y neuropatías retardadas, de alterar la transmisión nerviosa a través de los receptores GABAA, de los canales de sodio dependientes de voltaje y de los receptores ionotrópicos de glutamato, y de la utilización de los cultivos reagreagados de cerebro como modelo celular para la evaluación de neurotoxicidad en general. Estos métodos proporcionan información útil para una futura validación de los mismos (consultable en ecvam-dbalm.jrc.cec.eu.int). El metilmercurio (MeHg) es un contaminante ambiental con toxicidad selectiva para el SNC y en particular para las células granulares de cerebelo. El análisis proteómico de extractos proteicos procedentes de cultivos primarios de células granulares de cerebelo de ratón expuestos de forma prolongada a concentraciones subcitotóxicas de metilmercurio permitió identificar dos proteínas, la succinil CoA:3-cetoácido-CoA-transferasa I y la isoforma no muscular de la cofilina, cuya expresión disminuyó e incrementó en presencia de metilmercurio, respectivamente. La exposición prolongada de los cultivos primarios de células granulares de cerebelo a MeHg produce una muerte neuronal apoptótica tiempo y concentración dependiente que cursa por mecanismos no excitotóxicos, independientes de la activación de caspasa 3 y parcialmente dependientes de la liberación de la proteasa lisosomal catepsina D. Además la exposición a MeHg produjo un incremento de la peroxidación lipídica. En nuestro modelo experimental la muerte neuronal fue protegida por antioxidantes de amplio espectro hecho que sugiere que la muerte podría deberse al incremento de ROS intracelular.[eng] "Evaluation and development of alternative methods for prediction of neurotoxicity. Proteomic approach to methylmercury induced neurotoxicity": In the last years there has been a growing interest in using "in vitro" methods to detect toxic potentially chemical compounds, contributing in replacement, reduction and refinement animal use in life science research. Several organizations are working together to develop and validate alternative methods. Responding to the necessity to promote alternative methods in the neurotoxicity field, European Centre for the Validation of Alternative Methods (ECVAM) proposed the elaboration of an alternative methods database to detect chemical compounds potentially neurotoxic. The goals of this thesis include both bibliographic and experimental studies to (1) create a database for "in vitro" methods to detect neurotoxic chemical compounds, (2) to identify toxic biomarkers by using proteomics techniques in primary cultures of mouse cerebellar granule cells exposed to methylmercury (MeHg) and (3) to evaluate cell death and neuroprotection mechanisms involved in long-term MeHg toxicity in primary cultures of mouse cerebellar granule cells. As a result of the bibliographic study, 6 "in vitro" methods were proposed to evaluate neurotoxic potency of chemical compounds capable to produce axonopaties and delayed neuropaties, to affect neurotransmission through GABAA receptors, voltage dependent sodium channels or ionotropic glutamate receptors, or to produce neuronal and glial neurotoxicity. All this methods supplied useful information to a future method validation (now available in ecvam-dbalm.jrc.cec.eu.int). Methylmercury is an environmental contaminant with special toxicity to Central Nervous System (SNC) and in particular to cerebellar granule cells. A proteomic approach revealed that long-term MeHg exposure to primary cultures of cerebellar granule cells induced a subexpression of succinilCoA:3-ketoacidCoA transferase I (SCOT), enzyme implicated in the ketone body catabolism, and an overexpression of non-phosphorylated cofilin, an actin binding protein involved in the regulation of actin dynamics. On the other hand, long-term MeHg exposure to primary cultures of cerebellar granule neurons produced time- and concentration-dependent apoptotic cell death. This cell death was not an excitotoxic death and was independent of caspasse 3 activation but was partially dependent of lysosomal cathepsin D. Moreover, MeHg exposure produced an increased in lipid peroxidation. In this experimental model, neuronal cell death was protected by antioxidants of wide spectrum, suggesting that this apoptotic cell death could be due to the increased of intracellular reactive oxygen species (ROS)